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瓊脂糖凝膠電泳那些你一定要注意的小細(xì)節(jié)

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掃一掃!瓊脂糖凝膠電泳那些你一定要注意的小細(xì)節(jié)掃一掃!
瀏覽:- 發(fā)布日期:2023-05-10 11:23:09【

瓊脂糖凝膠電泳是利用DNA、RNA分子帶負(fù)電荷磷酸基團(tuán)的特性,通過(guò)電流使得片段大小不同的核酸由負(fù)極的凝膠孔中緩慢向正極移動(dòng),最終達(dá)到分離核酸分子的技術(shù)。由于分子量小的核酸片段在凝膠中移動(dòng)速度較快,分子量大的核酸片段移動(dòng)相對(duì)較慢的特點(diǎn),就可以將分子量不同的核酸片段區(qū)分開(kāi),再結(jié)合DNA Marker,即DNA分子量固定已知的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析,就可以準(zhǔn)確識(shí)別和判斷核酸片段大小,也就是跑出來(lái)的小東西到底是不是我們想要的目的基因。


瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)目前在生物學(xué)科中有非常廣泛的應(yīng)用,但是在這個(gè)過(guò)程中有幾點(diǎn)小細(xì)節(jié)還需要我們多多注意哦:

瓊脂糖凝膠制備。在制備之前,我們首先要確定瓊脂糖凝膠濃度,當(dāng)我們需要跑小片段核酸時(shí),就需要制備濃度較高的瓊脂糖凝膠,這樣DNA片段跑起來(lái)的阻力變大,速度變慢,反之亦然。通常情況下,瓊脂糖凝膠的濃度在1%左右,即1克瓊脂糖與100毫升電泳緩沖液混勻制成,二者體積總和不要超過(guò)錐形瓶的三分之一。搖晃混勻后用微波爐加熱到微沸狀態(tài),搖勻后繼續(xù)加熱至微沸狀態(tài),再次搖勻,反復(fù)多次,直至溶液變的清澈明亮。避免溶液暴沸的情況出現(xiàn),以免影響跑膠效果。冷水沖洗瓶壁略微降溫后添加適量核酸染料,搖勻倒入插入梳子的模具中,等待30-60 min凝膠完全凝固即可,盡量在3小時(shí)內(nèi)使用完畢。

樣品準(zhǔn)備。樣品在從PCR儀中取出后不要急于點(diǎn)樣,因?yàn)闃悠穭側(cè)〕鰰r(shí)管內(nèi)液體和氣體溫度很高,非?;钴S,馬上開(kāi)蓋會(huì)造成擴(kuò)增產(chǎn)物彌散到空氣中,造成實(shí)驗(yàn)室氣溶膠污染。所以可以在-20℃冷卻5 min,或在4℃冷卻20 min再離心上樣。樣品上樣前需要加入上樣緩沖液,混勻后取適當(dāng)?shù)牧浚?/span>5-10微升)緩慢注入梳子孔中,由于上樣緩沖液的作用,我們可以清晰看見(jiàn)樣品注入的過(guò)程,與電泳過(guò)程中核酸移動(dòng)的距離。

電泳。凝膠帶孔的一側(cè)放入負(fù)極一側(cè),因?yàn)楹怂針悠酚韶?fù)極移動(dòng)向正極,負(fù)極一般用黑色表示。電泳槽倒入與凝膠相同的電泳緩沖液,確保電泳槽液面可以沒(méi)過(guò)凝膠表面。必須注意點(diǎn)樣開(kāi)始和完畢后盡量不要移動(dòng)電泳槽,以免造成樣品擴(kuò)散到電泳液中。點(diǎn)樣完畢后靜置2 min,如若樣品過(guò)多,需要加快點(diǎn)樣速度,避免先點(diǎn)的樣品擴(kuò)散,影響條帶結(jié)果。上述工作完成后蓋嚴(yán)電泳槽蓋,打開(kāi)電源,電壓設(shè)置120V左右,跑膠20-30 min即可。注意觀察凝膠上染料移動(dòng)位置,進(jìn)而減少或增加時(shí)間。

結(jié)果判讀。取出凝膠放在切膠儀或凝膠成像分析儀上,用紫外燈照射觀察、拍照留存條帶結(jié)果。根據(jù)DNA Marker的條帶位置比照分析,得出目的條帶的位置(大?。?、亮度(數(shù)量)和非特異性擴(kuò)增(擴(kuò)增效果)。

結(jié)合上面的介紹,你有沒(méi)有存在日常操作中對(duì)小細(xì)節(jié)的疏忽呢?瓊脂糖凝膠電泳從制備、上樣、電泳和結(jié)果判讀,每一步環(huán)環(huán)相扣,一點(diǎn)點(diǎn)問(wèn)題都會(huì)體現(xiàn)在最終的結(jié)果上。在實(shí)驗(yàn)中為了更好的實(shí)驗(yàn)效果,推出瓊脂糖、TAE速溶粉末,核酸染料,上樣緩沖液等全套瓊脂糖凝膠電泳所需試劑,更有含染料的Taq酶預(yù)混液,不用再去加上樣緩沖液啦!擴(kuò)增完成即可直接點(diǎn)樣,省時(shí)省力,避免污染!你還在等什么?

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