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顯微鏡的種類

2019-09-03 16:16:27 

一般而言,用來觀察生物的顯微鏡依光源和透鏡系統(tǒng)的不同而區(qū)分,利用一般光線經(jīng)過透鏡聚焦后,使物體形成物像以便觀察者,有實(shí)體顯微鏡、及光學(xué)顯微鏡;利用雷射光者有雷射掃描共軛焦顯微鏡;利用波長極短的電子束者為電子顯微鏡,經(jīng)電磁透鏡聚焦,使極小的物體成像,目前常用的有掃瞄式電子顯微鏡穿透式電子顯微鏡。

(一)實(shí)體顯微鏡(Stereomicroscopy;解剖顯微鏡):解剖顯微鏡主要是用來觀察不透明的物體或生物標(biāo)本外部形態(tài),或在工業(yè)和部分生物醫(yī)學(xué)技術(shù) 上。此種顯微鏡受光源、景深和其他成像因子的影響,放大倍率在60倍以下,解像效果較佳。

(二)光學(xué)顯微鏡(Light microscopy) :一般簡稱為LM,二組透鏡及顯微鏡機(jī)械本體組成,主要是用來觀察生物體的器官組織結(jié)構(gòu)或生物細(xì)胞的內(nèi)部構(gòu)造。此種顯微鏡的二組透鏡,一組是接近觀察之標(biāo)本的透鏡稱為接物鏡或簡稱為物鏡,另一組是靠近眼睛稱為接目鏡或簡稱目鏡。物鏡位于物體標(biāo)本上方而由上往下觀察者為正立光學(xué)顯微鏡;物鏡位于物體標(biāo)本下方而由下往上觀察者為倒立光學(xué)顯微鏡。一般所觀察的呈像方式為明視野,但因所要觀察物特性或欲呈像之不同,有特別的附屬呈像系統(tǒng)。

1. 明視野(bright field):最基本的觀察模式,主要是用來觀察透或近乎透明的材料(物體或生物標(biāo)本)。此種顯微鏡觀察用的材料,除較簡單的低等生物(如細(xì)菌、真菌和大部分藻類等等)外,大都需用經(jīng)過事 先的處理和切成薄片,制作成臨時或永久切片后,才可以在顯微鏡下觀察。普通光學(xué)顯微鏡使用的光源可穿透標(biāo)本,故常用于觀察生物體
的器官組織結(jié)構(gòu)或生物細(xì)胞的內(nèi)部構(gòu)造。
2.暗視野(dark field):可將要件架設(shè)于明視野顯微鏡之主體上,利用一個不透光的濾片遮掉聚光鏡上大部分的光線,僅聚光鏡邊緣的光線可以通過,結(jié)果使整個視野變暗,而標(biāo)本物體的輪廓變亮,適合用于觀察小而薄、近乎透明或纖細(xì)的構(gòu)造,如細(xì)菌或鞭毛或用于微小個體計數(shù)。
3. 相位差(phase contrast):可將要件架設(shè)于明視野顯微鏡之主體上,利用光波通過標(biāo)本物體時,速度會被減緩或加速而與通過封片介質(zhì)之光 波產(chǎn)生“out of phase”的現(xiàn)象,造成光波互相干擾形成明暗對比,用以 觀察透明無色的物體。此類顯微鏡之聚光鏡有一phase ring,物鏡內(nèi)有一phase plate(鏡頭外刻有Ph字樣)。當(dāng)光線通過標(biāo)本時光波行進(jìn)速 度受影響,而與其他光線產(chǎn)生約90度的out of phase,再利用物鏡內(nèi)之 phase plate加強(qiáng)干擾作用,使通過物體邊緣的光加速,而與通過物體的光成180度的out of phase,形成破壞性干擾(destructive interference) 使物體影像變暗,但具有明亮之輪廓。
4.微分干涉差(differential interference contrast, DIC;Nomaski):可將要件架設(shè)于明視野顯微鏡之主體上,原理與位相差顯微鏡類似,但可用于觀察較厚的標(biāo)本,同時可觀察到3-D影像。首先利用偏光鏡將所有的 光波轉(zhuǎn)成在同一平面(方向)振動,在利用棱鏡(beam splitter)將半 數(shù)的光波轉(zhuǎn)成90度,當(dāng)光通過標(biāo)本時,標(biāo)本的化學(xué)結(jié)構(gòu)會使某一方向的光波波長較另一方向之光波短。在利用物鏡(此類物鏡外刻有DIC 字樣)上方的棱鏡(beam analyzer)將光拉回成束,造成光波波長差異形成干擾,使影像各部位呈現(xiàn)不同顏色,而使影像產(chǎn)生立體感。
5. 熒光(fluorescence):以波長較短的紫外光為光源,解像力較佳,同時利用紫外光射在熒光物質(zhì)上會激發(fā)出可見光的特性,適合用于特定對象之鑒別與定位。如以熒光物質(zhì)(如calcofluor)或以抗體結(jié)合熒光物 質(zhì)(如FITC),可用于標(biāo)定特定對象在組織內(nèi)的位置,此即熒光顯微 鏡技術(shù)。該設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、標(biāo)本準(zhǔn)備費(fèi)時為其缺點(diǎn),但結(jié)果的高度專一性與準(zhǔn)確性則非他種顯微鏡可取代。

(三)雷射掃描共軛焦顯微鏡(Radial Scanning Confocal Microscopy) :共軛焦顯微鏡所看到的影像只是一個極小的亮點(diǎn),而不是如傳統(tǒng)顯微鏡所看到 的二維空間影像;利用共軛焦顯微鏡內(nèi)建的掃描器,可將影像由很多點(diǎn)組 成線,很多線組成面,取得由點(diǎn)厚度所組成的單一平面影像稱為光切片 (optical sections)。光切片配合電腦輔助運(yùn)算處理,可呈現(xiàn)出兼具高解析度明視野(左)及熒光處理(右)于顯微鏡之觀察利用抗體結(jié)合熒光物質(zhì)后,抗體會與特定標(biāo)本細(xì)胞表面之抗原結(jié)合 (左),在熒光顯微鏡下即可觀察到發(fā)出熒光的特定標(biāo)本(右)。和低背景雜訊的二維空間相片;或?qū)⒍鄰埻矫娌煌瑹晒馓结樀南嗥?疊,可研究其相對部位的關(guān)系;或由一系列不同平面的相片,可組合成三 維空間的立體影像;再加入時間因子,可創(chuàng)造出動態(tài)的4D 影像。

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(四)電子顯微鏡:電子顯微鏡(Electron microscopy),一般簡稱為 EM,依成像的過程和構(gòu)造的復(fù)雜性,可分為掃描式和穿透式電子顯微鏡等二大類。 利用電子顯微鏡觀察之標(biāo)本實(shí)必需經(jīng)特殊步驟處理后,方可觀察。另外,還有掃描式原子探測顯微鏡,目前應(yīng)用于觀察原子或分子的形狀。 由于這些設(shè)備昂貴,皆屬于國家貴重儀器,且技術(shù)性高,需有專人處理。

1. 穿透式電子顯微鏡(TEM): 以電子槍(electron gun)發(fā)射之電子束 (electron beam)為光源,由于該波長極短,可以直接穿透 0.2 μm的標(biāo)本,使影像在 photographic plate上呈現(xiàn) 2-D 的結(jié)構(gòu)。

2. 掃描式電子顯微鏡(SEM): 以電子槍(electron gun)發(fā)射之一次電子束 (稱 primary electron beam)為光源,該波長極短,再照 射在樣品標(biāo)本 表面(通常外表鍍金)后,會激發(fā)二次電子束(secondary electron beam) 反射,使影像為電子接收器接收,經(jīng)一連串影像放大后,會在熒幕上呈 現(xiàn) 3-D 的物體外表影像結(jié)構(gòu)。


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