早在古羅馬時期，人們就已經(jīng)知道將一滴包含混合色素的溶液滴在一塊布或一片紙上，通過觀察溶液展開的同心圓環(huán)來分析染料和色素。這就是最古老的液相色譜分離技術(shù)。

二十世紀初期，俄國植物學家茨維特（Tsweet）在1906年發(fā)表的關(guān)于色譜的論文中寫到：將一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，然后用純石油醚淋洗，結(jié)果按照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀察到它們相應的色帶，他把這些色帶稱之為“色譜圖”（Chromatogram）。遺憾的是，在隨后的二十年內(nèi)這一新的分析技術(shù)都沒有得到科學界的注意和重視。

直到1931年，庫恩（Kohn）報道了他們關(guān)于胡蘿卜素的分離方法時，色譜法才引起了科學界的廣泛注意。

1941年，馬?。∕atin）和辛格（Synge）用一根裝滿硅膠微粒的色譜柱，成功地完成了乙?；被峄旌衔锏姆蛛x，建立了液液分配色譜方法，他們也因此獲得了1952年諾貝爾化學獎。1944年，康斯坦因（Consden）和馬?。∕atin）建立了紙色譜法。1949年，馬丁建立了色譜保留值與熱力學常數(shù)之間的基本關(guān)系式，奠定了物化色譜的基礎。1952年，馬丁和辛格創(chuàng)立了氣液色譜法，成功地分離了脂肪酸和脂肪胺系列，并對此法的理論與實驗做了精辟的論述，建立了塔板理論。1956年，斯達（Stall）建立了薄層色譜法。同年，范·底姆特（Van Deemter）提出了色譜理論方程；后來吉丁斯（Giddings）對此方程作了進一步改進，并提出了折合參數(shù)的概念。這一系列色譜技術(shù)和理論的發(fā)展都為HPLC的問世打下了扎實的基礎。

1960年代早期，由于氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，分析化學家們把目光轉(zhuǎn)向了液相色譜。液相色譜也的確從蛋白質(zhì)中分離出了純的化合物，但使用液相色譜又出現(xiàn)了一個新的問題：分離時間相當長。當時所使用的色譜柱效率非常低，具有代表性的柱子是一米來長或更長，為了獲得必要的分辨率，有時還得使用多根柱，液體流動的產(chǎn)生靠重力，其流動速度是每小時幾毫升或更少，無計算機自動操作儀器和進行數(shù)據(jù)收集。當時的生物學工作者往往要經(jīng)過好幾年的努力才能從一個組織中把蛋白質(zhì)完全分離出來。

在儀器發(fā)展方面，HPLC的第一個雛形是由斯坦因（Stein）和莫爾（Moore）于1958年發(fā)展起來的氨基酸分析儀（AAA），這種儀器能夠進行自動分離和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的分析。在六十年代早期的相關(guān)進展是莫爾（Moore）發(fā)展起來的凝膠滲透色譜（GPC）。不久以后，沃特世（Waters）有限公司制造了商業(yè)GPC儀，這種儀器經(jīng)過微小的改進之后可用于HPLC分離。

1968～1971年間，第一臺普遍適用的HPLC商用系統(tǒng)被推出。這種新的色譜儀是由科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath）、莆黑斯（Preiss）和里普斯克（Lipsky）等人研制發(fā)明的。從此，開啟了高效液相色譜的時代，也成之為現(xiàn)代液相色譜。

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